新型コロナ用VHH抗体 特設ページ

新型コロナウイルス、SARS-CoV-2に対するVHH抗体の作製

米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)が提供しているGeneBank上のSARS-CoV-2のゲノム塩基配列(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome, NCBI Reference Sequence: NC_045512.2)を解析し、スパイクタンパク質中のS1サブユニット部分の遺伝子を人工合成した。

この遺伝子から、S1サブユニット中に存在し、ヒト細胞表面に発現するSARS-CoV-2のレセプタータンパク質であるACE2(アンジオテンシン変換酵素2)に結合する、レセプター結合ドメイン(RBD)部分の遺伝子を大腸菌用タンパク質発現ベクターであるpET22bに連結し、RBD-6xHisタグ融合タンパク質を発現した。

Ni-NTAを使用したアフィニティー精製を行い、VHH抗体スクリーニング用標的抗原とした。コントロールとして、S1サブユニットのN末側およびC末側の6xHis融合タンパク質も調製した。

Spike protein

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200億の多様性から成る、VHH抗体提示ファージライブラリーを元に、3ラウンドのパニング法で結合性を有するVHH提示ファージを濃縮した後、単クローン化を行った。得られたVHH抗体クローンのFR3-CDR3-FR4遺伝子をPCRにより増幅し、10億の多様性を有するFR1-CDR1-FR2-CDR2遺伝子と連結し、ファージディスプレイ用ベクターに挿入後に大腸菌に形質転換することで、約1億の多様性をもつSARS-CoV-2特異的CDR3温存ライブラリーを作製した。

SARS-CoV-2特異的CDR3温存ライブラリーから、2ラウンドのパニング法で結合性を有するVHH提示ファージを濃縮した後、単クローン化を行い、総計19種類の異なるアミノ酸配列を有するクローンを得た。これらから5種類を選抜し、VHH-Fc(FcはマウスIgG1由来)発現コンストラクトを作製し、HEK293T細胞に一過性に形質導入し、その培養上清を用いてELISAを行った。

S1サブユニットの全長(S1-Full)、RBD、C末側の3種のタンパク質への結合を調べた結果、RBDおよびRBDを有するS1-Fullに特異的に結合することを確認した。また、HEK293T細胞で一過性に発現させたS1サブユニットタンパク質およびRBDにも結合することを確認した。

Spike protein2

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Western Blotで使用できるかを検証した結果、使用できることを確認した。

(表示データは2-メルカプトエタノール処理抗原を使用しているが、不使用の場合も検出可能である)

Spike protein3

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作製期間情報

工程 期間
SARS-CoV-2のゲノム塩基配列解析 1日間
S1サブユニット部分遺伝子人工合成 1週間(外部委託)
標的タンパク質の調製 4日間
パニング(3ラウンド)および単クローン化 8日間
VHH抗体遺伝子解析 3日間(外部委託)
CDR3温存ライブラリー構築 5日間
パニング(2ラウンド)および単クローン化 6日間
VHH抗体遺伝子解析 3日間(外部委託)
VHH抗体タンパク質の作製(大腸菌発現系) 4日間

※上記の期間は、比較的業務の少ない時期に緊急対応として行ったものであり、他の抗体作製が同じ期間でできるものではありません。

※上記の期間には、発注した部材等の到着待ち、他業務に費やした期間などを含めておりませんので、単純に加算した期間で作成されたものではありません。

ご提供方法

非営利目的の研究用として、取得VHH抗体情報、もしくは、発現ベクターを提供させていただきます。

提供方法は、次の2つより選択して下さい。

①PDFによるVHH抗体遺伝子配列情報と大腸菌系でのVHH抗体タンパク質発現・精製法プロトコルの提供

②VHH抗体-検出タグ-6xHisタグ融合タンパク質発現ベクター(T7プロモーター・大腸菌用、濾紙にプラスミドベクターを吸着して郵送)

ご希望の方は、以下の提供条項に同意の上、以下の申し込みフォームに必要事項を記載してお申し込みください。

なお、お申し込みされた方は、提供条項に同意されたものとみなさせていただきますので、内容を十分にご確認の上、同意頂ける場合のみお申し込みください。

提供条項

①提供物は非営利の研究目的のみに使用するものとし、商用、営利目的、ヒトに対する治療・診断・飲食物等に使用いたしません。

②提供物は私および私の属する研究グループ内のみが使用し、第三者には提供いたしません。

③提供物は研究の過程において生み出された実験的・研究的性質を有するものであり、RePHAGEN社は明示・暗示を問わず提供物に一切の保証をせず、使用・保守・保管によって発生したいかなる結果についても一切その責任を負わず、かつ直接または間接の損害を問わずいかなる損害・賠償請求・訴訟またはその他の損失に対して賠償義務を負わないものであることに同意します。

④提供物の取り扱いに際して私は、適用を受ける法令・規則を遵守します。

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沖縄ライフサイエンス研究センター120号室

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